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恒峰娱乐备用网站传奇PCR:从科学狂想到普通医学检验室这个故事里每个关键人物都手

来源:新2娱乐官网 时间:2018-09-16

  1993年,Kary Mullis因发明了聚合酶链式反应(PCR)获得了诺贝尔化学奖[1]。1998年,《纽约时报》一篇文章提到PCR时,不吝惜赞美地写道,“生物学以此划分为PCR前和PCR后两个时期。”[2]

  这并非溢美之词。自双螺旋被阐明,人们对生命的理解进入DNA分子时代,几乎所有需要研究遗传物质的人,都无法离开PCR。

  在它出现以前,扩增DNA序列需要在细菌中进行,整个过程可能需要几周;使用PCR,你只需要几个EP管,把原材料加进去丢进热循环仪,然后静静等上几个小时,就能够得到几何数级的产物。

  说起来还真有点儿怪,PCR使用范围之广,很难让人相信它是一种出现还不到半个世纪的技术。换个角度理解,PCR也可以算是某种程度的厚积薄发,它能够取得今日的成就,还是因为站在巨人的肩膀上。

  1953年4月,DNA的双螺旋结构首次与世人见面[4],人类对生命终极的认知走入了分子层面,发现者之三Waston、Crick和Wilkins因此在1962年被授予诺贝尔生理学或医学奖。

  1957年,美国科学家Arthur Kornberg发现了第一种DNA聚合酶[5],人类了解到,DNA的复制是在引物引导下、由酶的作用、以脱氧核苷酸为材料向单一方向延伸。当然,在复制之前,还有更复杂的打开双螺旋等等过程。Kornberg在1959年获得了诺贝尔奖。

  差不多同一时期,印度裔美国科学家H.Gobind Khorana成功破解了所有的密码子。为了完成人类功能性基因全合成的伟愿[6],他在此后的科研生涯中开创了许多合成寡核苷酸所需要的技术。1968年,他因破解遗传密码获得诺贝尔奖。

  三年后,Khorana和他的学生Kleppe在《分子生物学杂志》上发表了一篇论文[7],文内首次提到了双引物系统和“修补复制”的概念,这是PCR技术的雏形。

  1976年,Jhon Trela和他的学生,华人科学家钱嘉韵成功从该菌种内提取到了能够耐75℃以上高温的TaqDNA聚合酶[9]。

  1971年,Cetus Coporation宣告成立,这家公司的创始人之一Donald Glaser是1960年诺贝尔物理学奖获奖者。顶尖的科学家、前沿的科学视角,让这家公司成为日后孕育PCR技术的摇篮。

  1977年,Frederick Sanger发明了桑格测序法[10],基因组全面向人类敞开,再无秘密。他因此在1980年获得诺贝尔化学奖。

  至此为止,PCR技术所需的所有基础材料都已摆上桌台,只剩耐心等待天选之人的到来。

  Cetus是出现得最早的生物技术公司之一,只可惜,这家本有希望成为业界领头羊的公司只在历史上出现了短短20年。这短暂的时光里,它带来了包括白介素-2、β干扰素在内的几种重要药物,以及最关键的PCR技术。

  Cetus也很关注DNA诊断,它与Perkin-Elmer共同研发了第一台热循环仪,还与柯达合作商用诊断试剂盒(对就是那个柯达)。

  创始之初,Cetus致力于研究工程菌的自动化筛选方法,这些细菌可以用于生产大量的化学原料、抗生素以及疫苗的组分。

  那个年代,生物学时时刻刻都在发生巨变,没过几年,DNA重组技术、单克隆抗体、基因表达这三项革命性的技术出现,新的生物技术产业即将成型。Cetus快速跟上节奏,1981年首次公开募股,便筹集了1.08亿美元。这个数字即使放到今天,也值得称上一句天价IPO。

  Cetus的业务中心主要都放在白介素-2上。这块竞争十分激烈,除了Cetus以外,还有Genentech、Immunex(后来成了Amgen的一部分)等颇有实力的公司,以及一位名为Tadatsugu Taniguchi的日本研究者在进行IL-2基因的克隆研究。

  1982年,Taniguchi率先完成了人源IL-2的克隆,不过次年Cetus就搞定了独家的重组版本,同时用于治疗肾癌的临床试验也开始进行了[11]。

  看看现在IL-2用得多广,我们就知道这块蛋糕确实美味。Cetus对它寄予厚望,几乎把全公司的资源都倾倒在IL-2的开发上,甚至在FDA还没有批准上市之前,Cetus已经为IL-2建造了两座工厂和配套的基础设施,前期的资金投入高达1.27亿美元。

  值得一提的是,为了支持IL-2的研发,Cetus从1987年开始就对外授权PCR技术的使用,尽管当时很多外部人都认为PCR才是Cetus最有价值的产品。

  然而很悲剧,1990年,FDA驳回了Cetus对IL-2的上市申请。实际上当时Cetus的IL-2产品,患者的响应率并不是很高,只有10%-20%的肾癌患者获得了有效治疗;与之相对的是,药物的副作用巨大,严重的液体潴留可能会危及患者生命[12]。

  FDA认为还需要更多的临床试验来验证IL-2的效果,现在它还未到时候。可是Cetus等不起了。当年,Cetus年报亏损23%,CEO辞职,公司不得不通过大幅度裁员来消减成本。

  然而这也没能拯救Cetus下坠的趋势。1991年,Cetus被成立于1981年的后起之秀Chiron以7亿美元的价格收购。次年,IL-2才以Prileukin之名进入市场,同时PCR技术专利被罗氏控股Hoffman公司以3亿美元全盘收购。

  说来遗憾,Cetus拥有当时业界顶尖的科学家、雄厚的资本、有前景的产品,但是在IL-2上过于孤注一掷。这赌博似的行为导致了全盘皆输,Cetus一夜消失在了历史的洪流里。

  现在让我们回到1953年,双螺旋发现的那一年。那年Kary Mullis 8岁,正是和小伙伴们漫山遍野瞎跑的年纪。在他出生的1944年,薛定谔出版了《生命是什么》。当然了,8岁的他既看不懂这部生物学著作,也完全理解不了DNA结构的发现到底意味着什么。事实上很长一段时间里,他都对生物学毫无兴趣。

  比起生物,Mullis反倒在化学领域上显得颇有天赋。十几岁的时候,他就从家里偷来糖,混上药店里买来的硝酸钾,和小伙伴们自制火箭;在乔治亚理工学院修习化学学位期间,他也常常自己合成有毒物质和爆炸物。很幸运,几乎没人管他,那段时光让Mullis掌握了不少有机化学知识。

  所以到底为什么他选择了生物化学作为接下来的研究方向呢?Mullis自述只对小分子感兴趣,而PCR出现之前的DNA又长又“稳如泰山”,和他喜欢的化学合成完全搭不上边。修完硕士修博士,在加州大学伯克利分校读了六年生物化学,到1972年毕业,Mullis依旧是只懂化学,不懂生物。

  好在他的导师Joe Neilands很宽容,他并不限制学生选课程,所以Mullis赫然选修了一门天体物理学。神奇的是这门课他可能学得不错,甚至在1968年时发表了一篇名为《十年逆转的宇宙学意义》的论文,发在《自然》上。多亏了这篇论文,要不然他恐怕拿不到博士学位。

  毕业后,Mullis没有想好要做什么,于是就先随着妻子来到堪萨斯州。起初他想当个作家(执念很深,后来确实出书了),但是遗憾的是毫无天赋。随后他在医院工作了一段时间,又因为离婚回了伯克利,做了两年餐馆的经理人。

  这里要提到一位好朋友Tomas White,是这位朋友劝说他回到学校继续深造,也是White介绍他到Cetus工作,后来又在Mullis难以立足的时候拉了他一把。

  Mullis来到加州大学旧金山分校,进行药物化学的博士后研究。学习期间,他了解到,DNA也可以通过化学方法来合成。Mullis对此产生了兴趣。1979年,他来到Cetus的时候,也是负责合成寡核苷酸,给公司其他部门的同事使用。

  Mullis确实在化学合成上有天赋,他很快搞出了计算机自动合成程序,工作流程大大简化。1981年,他就当上了实验室的负责人。

  1983年春天的一个夜晚,Mullis载着当时同在Cetus工作的女友从旧金山前往乡下度过周末。汽车行驶在蜿蜒盘旋的128号公路上,此时一个念头出现在Mullis的脑海中——扩增DNA片段时,如果同时添加两条引物,分别扩增正义链和反义链,那么只要引物足够,岂不是可以无限循环地扩增下去!

  Mullis马上靠边停车,掏出纸笔开始演算。这种扩增方法,每个循环得到的DNA都是上一循环的二倍,那么循环10次DNA就能扩增1000倍,循环个30次就能达到10亿倍!

  这个数字太惊人了,这个思路也太简洁了,Mullis一时之间都无法相信,之前居然从未有人尝试过。他反复查阅资料之后,在Cetus内部的科研会议上分享了自己的想法。然而奇怪的是,同事们完全不觉这有什么厉害之处。

  Mullis花了几个月时间寻求认同,但赞同他观点的科学家寥寥无几,这期间他与女友的感情也出现了裂缝,直到9月,他才开始第一次实验。

  在诺奖致辞中,Mullis提到他不喜欢重复劳动,如果一件事需要反复做同一个流程,那么他会倾向于写个程序来解决。所以那个夜晚,他把聚合酶加入试管后就径直回家了,满心以为DNA已经在管中自己成倍增加了。

  然而第二天中午,Mullis没能在凝胶中看到期望的条带。他不得不承认,反复地加热、冷却、添加聚合酶,这枯燥的工作是绕不过去的坎儿。

  接下来的三个月里,Mullis磨磨蹭蹭地进行着实验,同时为了感情问题焦头烂额。终于在飘雪的圣诞节,他终于成功实现了扩增一个pBR322质粒的一个25bp长的片段,同时也失去了爱情。

  事情进展并不顺利。1984年中,Mullis再次在Cetus的会议上向同事汇报了自己的成果,结果依旧无人感兴趣。也是在这个会上,Mullis和另外一位同事发生了口角,上升到了肢体冲突。这个突发事件以Mullis降职、另一人离开公司结束。

  Mullis的好友White此时已经当上了Cetus的技术副总裁,他帮助Mullis拉起一支小组专门研究PCR,其中有个名为才木的日本人。不知是不是日本人天性严谨又勤劳,这支小组成立后,研究很快得到了推进,他们成功扩增了一个110bp的人源蛋白基因片段。

  进行了更多的尝试之后,研究者们决定撰写两篇论文,Mullis主导的一篇介绍PCR技术理论,才木主导的另一篇介绍PCR技术的应用。

  出于某些原因——笔者本人相信可能是Mullis的拖延癌又犯了——当才木的论文写好时,Mullis几乎还没动笔。

  在前几节我们提过,此时Cetus正把全力投在IL-2开发上,公司急于从科研公司转型到制药公司,没有时间耗费在不知能不能变现的技术上。高层没法等Mullis完成论文,便催促才木赶快先把应用论文发表。

  12月,才木的论文发表在了《科学》上,题目是《β-珠蛋白基因组序列的酶促扩增和限制性位点分析诊断镰状细胞贫血》[13]。

  Mullis的论文就没那么好运了,他先后投了《自然》和《科学》,都因为内容不够“原创”被拒稿,最后不得已投了《酶学方法》,论文直到1987年才出版[14]。

  同一年里,Cetus内另一组科学家也在为PCR的进化添砖加瓦。PCR最初的版本使用的是来自大肠杆菌的DNA聚合酶,这种酶不耐热,必须每个循环都重新添加,大大降低了自动化程度。

  从耐热菌中分离聚合酶的想法是谁提出的不确定,最后进行这项工作的是David Gelfand和Susanna Stoffel。两位科学家在秋天从Thermus aquaticus中分离到了能够在95℃高温下依旧不失活的TaqDNA聚合酶,Taq酶马上就被应用到了PCR中。

  看起来PCR已经走过最艰难的时刻,是该享受光辉和荣耀的时候了。然而不知为什么,共过苦的伙伴,却很难同甘。

  一方面,是PCR发明人的身份争议;另一方面,Cetus对PCR团队也着实不太公平,虽然Mullis获得了一万美元的奖金,但是团队里的其他人只是象征性地收到了一美元,这让他们与其他团队之间的分歧更大了。1986年,Mullis选择了离开Cetus。

  1991年,Cetus折戟梦途;1992年,身价3亿美金的PCR专利去往新东家Hofmann-La Roche;1993年,Mullis登上诺贝尔领奖台,大谈童年时光与128号公路上的那个夜晚[15]。

  Mullis与PCR的故事其实到这里就差不多已经全部说完了。纵观他的一生,Mullis表现出很多并不那么像个德高望重的诺奖获得者的特征。

  Mullis在诺贝尔获奖致辞中反复提到分手的女友,甚至表示获奖的喜悦也抵消不了失去这个姑娘的悲伤——就算那已经是十年前的事情了——表现得像个痴心的情圣,可他50岁前就结了四次婚。据称他在男女关系上确实不那么保守,也曾因此在公司内引发问题。

  White把Mullis描述为一个充满创造力,但是有些过于随心所欲的角色[16]。Mullis才华横溢,而且没有对权威的畏惧,但是另一方面他并不那么自律,实验进行得断断续续,这是他无法在Cetus内部取信于人的原因之一。他俩的友谊最后没能持续下去,但在之后的舆论纷争中White一直站在Mullis的一边。

  Mullis还有些不那么登得上台面的小爱好。1938年,Albert Hofmann首次合成了LSD,这种物质在十年后被引入精神疾病治疗领域,然后在短短几年时间内成了倍受年轻人喜爱的时髦小玩意儿,成为史上最有名的致幻剂[17]。Mullis上学的时候也好这一口——这是他亲口告诉Hofmann的——并且Mullis认为LSD带来的幻觉帮助他在128号公路上找到了PCR的灵感。

  Mullis还有些甚至不太像科学家的地方。比如他认为HIV病毒并非AIDS的病因、全球变暖是个伪命题;他相信占星术,相信转世,还宣称自己曾与伪装成荧光浣熊的外星人对线]。

  还有一个有趣的细节。前文曾讲过,Kleppe1971年发在《分子生物学杂志》上的论文首次提到了修补复制的概念,也提到了双引物系统。

  巧了,这位科学家正是Mullis就读加州大学伯克利分校期间的一位老师,而Linn也的的确确曾在课堂上演示过Kleppe的设想,实验也成功了。所以Rainbow认为,Mullis可能只是个“追随者”,并非“开创者”。

  Mullis是个“好人”吗?我们不知道。但是PCR,真真实实地改变了世界。

  PCR诞生之后,科学家们迅速意识到了这门新技术的价值,Cetus内部即有学者开始尝试使用PCR测定血液中的HIV病毒循环量,并很快取得了关键的突破[19]。基于这项成果,人们得已对捐献的血液进行病毒筛查,并直接检测抗病毒药物的疗效。

  这项技术在几年内得到了极大的发展。基于PCR bug一样的的扩增能力,从极微量的样本中提取遗传信息成为可能。最直观的应用就是在法医学上,例如著名的辛普森杀妻案,能够给犯人定罪就少不了PCR的功劳。

  还有考古学,有了PCR就可以从几万年前的化石里获取来自远古的遗传信息用于分析,如果将来真的像《侏罗纪公园》那样重新培育出恐龙,PCR技术一定不会缺席。更近一些,最有名的故事可能是寻回英国国王理查三世遗体的故事了(就是莎士比亚那个理查三世)。

  理查三世是金雀花王朝的最后一位国王,在玫瑰战争的最后一场战役里,他与自己的士兵一起葬身战场、匆匆被埋葬,以至于之后的五个多世纪都没能找回。直到21世纪到来,通过放射性碳测年找到尸骨、与其姐姐女性后代比对线粒体DNA,这才确认了理查三世的尸骨并重新安葬[20]。

  在医疗方面,PCR才是真正的改变了世界。产前检测、组织分型、癌基因突变检测、诊断传染病、鉴定微生物……有了PCR的出现,人类以前所未有的速度认识了这个世界,逐渐把生命的真相抓在手中。

  结合新出现的事物,PCR还在不断地出现新的变体。2018年,PCR技术35周岁,而立之年,仍旧大有可为。

  如果说PCR有什么缺点,那么可能成本是个问题。PCR最关键的过程就是热循环,为了保证精准的温度变化,昂贵而笨重的设备必不可少,这使得PCR的使用限于实验室内。

  近年来有研究者试图解决这个问题。他们采用一些更加轻薄、体积更小的薄膜电阻加热器,取代传统的热电装置,其他结构也选了更加简单的部件。这种新的名为MiniPCR的系统更小更轻,而且更便宜。

  这种设备很适合中等教育需求,一些野外科学家、食品公司都在使用这个系统。最令人惊喜的是,这种设备很适应太空环境,国际空间站的工程师也在使用。

  还有些科学家正在试图让PCR出现在我们的手机上。Biomeme尝试把光学传感器安装到手机上,用APP监控实时定量PCR(RT-qPCR),能够在线分析数据,并且在手机上实时检查实验进度。

  用PCR进行微生物检测也有了新的进展。日本一家乳品公司的科学家正在开发一种基于钯的试剂,这是一种DNA交联剂,能够特异性进入死亡的细菌,防止其DNA的扩增。使用这种技术,PCR可以快速检测生产的食品中是否含有未被杀死的致病菌[21]。

  还有我们最关注的癌症。液滴数字PCR(ddPCR)出现了,它的特点在于PCR反应是在上千个纳米级别的液滴中进行的,每个液滴都是单独的反应池,通过荧光标记来检测靶序列的含量。这种技术精度更高、需要的样品量更少,在液体活检领域可以大显身手。

  而且或许在不久之后,使用PCR可能不需要再重复加热、退火这个过程了。科学家们已经发现了能够在恒定温度下进行DNA复制循环的酶。等温扩增(LAMP)除了不需使用热循环仪进行操作,还能够直接分析新鲜或冷冻血液样本中的点突变,甚至是纸张上面的干血斑也行,再也不用提取DNA了[22]。

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